Репликация идет в направлении. Репликация в биологии - это важный молекулярный процесс клеток организма

Репликация – это процесс удвоения ДНК, в процессе репликации каждая цепь материнской ДНК служит матрицей длясинтезы новой дочерней цепи. Репликация происходит в S-фазу клеточного цикла. Хромосома содержит 1ну двухцепочечную молекулу ДНК.

Основы для репликации:

1. Принцип комплементарности (взаимосоответствия) – способность формировать водородные связи.

2. Матричный принцип – каждая из 2х нитей – матрица для создания комплементарной дочерней цепи.

3. Полуконсервативный механизм – при удвоении ДНК новая двухцепочечная молекула содержит 1ну исходную цепь и 1ну вновь синтезированную.

Условия репликации:

1) Матрица – 2 расплетенные нити ДНК, образующие репликационную вилку.

2) Субстраты и источники энергии для синтеза – дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ)

3) Ионы Mg

4) Репликативный комплекс ферментов:

ü ДНК-хеликаза – расплетает двойную спираль ДНК и разрывает водородные связи.

ü ДНК-топоизомераза 1и2 – устраняют суперспирализацию ДНК в точке разрыва, облегчая формирование репликационной вилки.

ü SSB-белки – связываются с одноцепочечными нитями ДНК и препятствуют их повторному комплементарному соединению.

ü ДНК-полимераза – катализирует образование фосфодиэфирных связей между нуклеотидами и удлинение уже существующей цепи. 2 свободных нуклеотида она соединять не может.

ü Праймаза – катализирует синтез олигорибонуклеотидов – коротких молекул РНК.

ü ДНК -лигаза – соединяет фрагменты ДНК.

ü Теломераза – обеспечивает построение концов ДНК.

ü Этапы репликации:

ü Инициация – формирование репликативной вилки при участии ДНК-хеликазы и ДНК-топоизомераз, в итоге происходит разделение цепей ДНК, а приссоединенные SSB-белки препятствуют повторному соединению цепей. Инициация происходит в нескольких точках – точках инициации или ориджины репликации. Единица репликации эукариот - репликон – участок между соседними ориджинами.

ü Элонгация – синтез новой цепи ДНК, она начинается праймазой, которая синтезирует олигорибонуклеотиды – праймеры. Далее синтез дочерней цепи ДНК происходит за счет полимеразы от 5` к 3` концу. Новые цепи синтезируются неодинаково. На 1ой цепи ДНК 5`- 3`цепь растет непрерывно, быстро и называется лидирующей. На другой нити ДНК новая цепь синтезируется в виде фрагментов Оказаки – эта цепь называется отстающей .

ü Терминация – удаление праймеров и завершение формирования отстающей цепи ДНК. Праймеры удаляются эндонуклеазой, а на их месте ДНК-полимераза достраивает ДНК. Сшивание фрагментов происходит за счет ДНК-лигазы. В итоге на каждой матричной ДНК формируется 2 дочернии копии ДНК.

27. Современные представления о структуре и функциях нуклеиновых кислот. Строение мономеров нуклеиновых кислот. Генетический код и его свойства .Нуклеиновые кислоты - это биополимеры, макромолекулы которых состоят из многократно повторяющихся звеньев - нуклеотидов. Поэтому их называют также полинуклеотидами. Важнейшей характеристикой нуклеиновых кислот является их нуклеотидный состав. В состав нуклеотида - структурного звена нуклеиновых кислот - входят три составные части:

азотистое основание - пиримидиновое или пуриновое. В нуклеиновых кислотах содержатся основания 4-х разных видов: два из них относятся к классу пуринов и два – к классу пиримидинов. Азот, содержащийся в кольцах, придает молекулам основные свойства.

моносахарид - рибоза или 2-дезоксирибоза. Сахар, входящий в состав нуклеотида, содержит пять углеродных атомов, т.е. представляет собой пентозу. В зависимости от вида пентозы, присутствующей в нуклеотиде, различают два вида нуклеиновых кислот – рибонуклеиновые кислоты (РНК), которые содержат рибозу, и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), содержащие дизоксирибозу.

остаток фосфорной кислоты . Нуклеиновые кислоты являются кислотами потому, что в их молекулах содержится фосфорная кислота. Мономерами в нуклеиновых кислотах служат нуклеотиды.В ДНК входят четыре вида нуклеотидов, отличающихся по азотистому основанию в их составе А,Г,Ц,Т. В молекуле РНК также имеется 4 вида нуклеотидов с одним из азотистых оснований -А,Г,Ц,У

Аденин тимин цитозин урацил(пир) гуанин(пур)

Генетический код – способ записи информации об аминокислотной последовательности белков с помощью последовательности нуклеотидов ДНК или РНК.

Свойства:

1. Триплетность – 3 нуклеотидных остатка (триплет, кодон) кодируют 1 АК. Помимо смысловых есть: АУГ – стартовый триплет, УАА,УГА,УАГ – терминирующие триплеты, которые являются сигналом к прекращению синтеза белка.

2. Квазидуплетность – информацию об АК несут первые два нуклеотида в составе триплета, 3ий малозначим.

3. Однозначность (специфичность) – каждый триплет кодирует одну аминокислоту.

4. Вырожденность – одну аминокислоту могут кодировать несколько триплетов.

5. Универсальность – у всех видов организаций биологический код одинаков.

6. Линейность (однонаправленность) – информация заключенная в зрелой м-РНК в виде последовательности триплетов в процессе трансляции считывается в определенном направлении последовательно без остановок и перерывов.

7. Колинеарность – соответствие последовательности кодонов зрелой м-РНК, последовательности АК в синтезируемом белке.

Расшифровка структуры молекулы ДНК помогла объяснить и принцип ее репликации (удвоения) в клетке. Этот принцип состоит в том, что каждая из двух полинуклеотидных нитей молекулы ДНК служит в качестве программы (матрицы) для синтеза новой (комплементарной) нити. В результате на основе одной двухцепочечной молекулы образуются две одинаковые двухцепочечные молекулы, в каждой из которых одна цепочка является старой, а другая - новой (вновь синтезированной). Такой принцип репликации ДНК был назван полуконсервативным (рис. 5.12). В соответствии с этим принципом нуклеотидная последовательность матричной (родительской) нити считывается в направлении 3"->5’, тогда как синтез новой (дочерней) нити идет в направлении 5"-?З". Поскольку две комплементарные цепочки родительской молекулы ДНК являются антипараллельными, то синтез новой полинуклеотидной цепочки на каждой из них идет в противоположном направлении.

Рис. 5.12.

Механизм репликации ДНК является достаточно сложным и, вероятно, различается в случае организмов, содержащих относительно небольшие по размерам молекулы ДНК в замкнутой (кольцевой) форме (многие вирусы и бактерии), и эукариот, клетки которых имеют молекулы огромных размеров, находящиеся в линейной (незамкнутой) форме.

Небольшая кольцевая молекула ДНК представляет собой одну структурную единицу репликации (репликон), имеющую единственную точку начала (инициации) репликации (0-пункт, состоящий примерно из 300 нуклеотидов), в которой начинается процесс расхождения (расплетания) двух нитей родительской молекулы и матричного синтеза комплементарных копий (реплик) дочерней ДНК. Этот процесс продолжается непрерывно по длине копируемой структуры и заканчивается в этом же репликоне образованием двух молекул «полуконсервативного» типа. В больших линейных молекулах ДНК эукариот имеется много точек начала репликации и соответствующих им репликонов (от нескольких сотен до десятков тысяч), т. е. такая ДНК является полирепликонной.

При рассмотрении современных представлений о механизме репликации ДНК эукариот можно условно выделить гри последовательных этапа этого процесса, происходящего в репликоне, в каждом из которых принимают участие те или иные белки (ферменты).

Первый этап связан с быстрым раскручиванием двух полинуклеотидных нитей спирализованной молекулы ДНК на определенном ее участке (в границах работающего репликона) и с их разделением путем разрушения водородных связей между парами комплементарных оснований. При этом образуются два одноцепочечных фрагмента родительской молекулы, каждый из которых может высту пать в роли матрицы для синтеза комплементарной (дочерней) нити. Этот этап инициируется в соответствующей точке начата репликации и обеспечивается комплексным участием нескольких различных белков. В результате их действия формируется У-образная структура, названная вилкой репликации, в которой две родительские цепочки ДНК уже отделены друг от друга (рис. 5.13). Образовавшаяся вилка репликации быстро продвигается вдоль двойной спирали родительской молекулы ДНК благодаря активности «расплетающего» фермента ДНК-гсликазы и при участии группы дестабилизирующих белков. Эти белки обладают способностью связываться только с одноцепочечными (уже раскрученными и разделенными) участками молекулы, препятствуя возникновению на них вторичных складчатых образований («шпилек») за счет случайных соединений между комплементарными нуклеотидами однони- тевой структуры. Следовательно, они способствуют выпрямлению однони- тевьгх участков молекулы, что необходимо для нормального выполнения ими матричных функций.

Рис. 5.13.

Быстрое расплетание ДНК с помощью геликазы без дополнительного вращения нитей по отношению друг к другу должно приводить к образованию на участках родительской молекулы перед движущейся вилкой репликации новых витков (узлов), создающих на них повышенное топологическое напряжение. Такое напряжение устраняется еще одним белком (ДНК-топоизомеразой), который, перемещаясь вдоль двухспиральной родительской ДНК перед вилкой репликации, вызывает временные разрывы в одной из цепочек молекулы, разрушая фосфодиэфирные связи и присоединяясь к разорванному концу. Возникший разрыв обеспечивает последующее вращение нити двойной спирали, что, в свою очередь, приводит к расплетанию образующихся супервитков (узлов). Поскольку разрыв поли- нуклеотидной цепочки, вызванный топоизомеразой, носит обратимый характер, то разорванные концы быстро воссоединяются сразу после разрушения комплекса этого белка с разорванным концом.

На втором этапе происходит матричный синтез новых (дочерних) Полину клеотидных цепей на основе принципа комплементарного соответствия нуклеотидов старой (матричной) и новой цепей. Этот процесс осуществляется путем соединения (полимеризации) нуклеотидов новой цепи с помощью ферментов ДНК-полимераз нескольких типов (ферменты Pol a, Pol р, Pol у, Pol 6, Pol е). Следует отметить, что ни одна из известных сегодня ДНК-полимераз не способна начать синтез нового полинуклеотида путем простого соединения двух свободных нуклеотидов. Инициация этого процесса требует наличия свободного З"-конца какой-либо полинуклеотидной цепочки ДНК (либо РНК), которая соединена с другой (комплементарной) цепочкой ДНК. Иными словами, ДНК-полимераза способна лишь добавлять новые нуклеотиды к свободному З"-концу имеющегося полинуклеотида и, следовательно, наращивать эту структуру только в направлении 5*-*?3".

С учетом указанного обстоятельства становится понятным асимметричный характер функционирования вилки репликации (рис. 5.13, 5.14). Как видно из приведенных схем, на одной из матричных нитей вилки (3"-*5") идет относительно быстрый и непрерывный синтез дочерней нити (ведущей, или лидирующей, цепочки) в направлении 5"->3’, тогда как на другой матрице (5"->3") идет более медленный и прерывистый синтез отстающей цепочки короткими фрагментами (100-200 нуклеотидов), получившими название фрагментов Оказаки, и также в направлении 5’-?3". Считается, что синтез ведущей и отстающей цепочек осуществляют ДНК-полимеразы разных типов. Свободный З’-конец, необходимый для начала синтеза фрагмента Оказаки, обеспечивается короткой нитью РНК (около 10 нуклеотидов), получившей название РНК-праймера (РНК-затравки), которая синтезируется с помощью фермента РНК-праймазы. РНК- праймеры могут комплементарно спариваться сразу с несколькими участками на матричной нити ДНК, создавая условия для одновременного синтеза нескольких фрагментов Оказаки при участии ДНК-полимеразы Ш (рис. 5.14). Когда синтезированный фрагмент Оказаки достигает 5"-конца очередного РНК-праймера, начинает проявляться 5"-экзонуклеазиая активность ДНК-полимеразы I, которая последовательно выщепляет нуклеотиды РНК в направлении 5*-?З*. При этом удаляемый РНК-праймер замещается соответствующим фрагментом ДНК.

Последний (третий) этап рассматриваемого процесса связан с действием фермента ДНК-лигазы, который соединяет З"-ОН-конец одного из фрагментов Оказаки с 5"-Р04-концом соседнего фрагмента с образованием фос- фодиэфирной связи, восстанавливая таким образом первичную структуру отстающей цепочки, синтезируемой в функционирующем репликоне. Дальнейшая спирализация появившегося «полуконсервативного» участка ДНК (закручивание спирали) происходит с участием ДНК-гиразы (катализирует формирование негативных супервитков в ДНК) и некоторых других белков.

Рис. 5.14.

Полирепликонный принцип организации молекулы ДНК различных эукариот, в том числе человека, обеспечивает возможность последовательного копирования генетического материала этих организмов без одновременного раскручивания (деспирализации) всей огромной по размерам и сложно упакованной молекулы, что значительно сокращает время ее репликации.

Генетический анализ процесса репликации ДНК у эукариот по сравнению с прокариотами выявил в основных чертах общность синтеза ДНК у этих объектов. В эукариотических клетках были выявлены и выделены в чистом виде ферменты, обладающие геликазной и топоизомеразной активностями, а также белки, специфически связывающиеся с одноцепочечными участками ДНК. Обнаружено три вида ДНК-полимеразной активности: ферменты Pol а (основная полимераза), Pol р (участвует в репарационных процессах), Pol у (митохондриальная полимераза).

Иными словами, в тот или иной момент времени в одной группе репликонов молекулы процесс копирования может быть уже завершен объединением и спирализацией соответствующих участков, тогда как в другой группе - только начинаться расплетанием двухнитевых структур.

Является молекулой наследственности, то для реализации этого качества она должна точно копировать саму себя и таким образом сохранять всю имеющуюся в исходной молекуле ДНК информацию в виде определенной последовательности нуклеотидов. Это обеспечивается за счет особого процесса, предшествующего делению любой клетки организма, который называется репликацией ДНК.

Суть репликации днк заключается в том, что специальный фермент разрывает слабые водородные связи, которые соединяют между собой нуклеотиды двух цепей. В результате цепи ДНК разъединяются, и из каждой цепи «торчат» свободные азотистые основания (возникновение так называемой вилки репликации). Особый фермент ДНК-полимераза начинает двигаться вдоль свободной цепи ДНК от 5- к З-концу (лидирующая цепь), помогая присоединиться свободным нуклеотидам, постоянно синтезируемым в клетке, к З"-концу вновь синтезируемой цепи ДНК. На второй нити ДНК (отстающая нить) новая ДНК образуется в виде небольших сегментов, состоящих из 1000-2000 нуклеотидов (фрагменты Оказаки).

Для начала репликации днк фрагментов этой нити требуется синтез коротких фрагментов РНК (о характерных особенностях РНК будет сказано ниже) как затравок, для чего используется особый фермент — РНК-полимераза (праймаза). Впоследствии праймеры РНК удаляются, в образовавшиеся бреши встраивается ДНК с помощью ДНК полимеразы I. Таким образом, каждая цепь ДНК используется как матрица или шаблон для построения комплементарной цепи и репликация ДНК является полуконсервативной (т.е. одна нить в новой молекуле ДНК — «старая», а вторая — новая).

Для репликации лидирующей и отстающей цепей клеткой используют разные ферменты. В результате репликации образуются две новые абсолютно идентичные молекулы ДНК, идентичные также исходной молекуле ДНК до начала ее редупликации (более подробно процесс репликации ДНК показан на рис. 3.5). ДНК-полимераза, как и любой другой фермент, существенно ускоряет процесс присоединения комплементарных нуклеотидов к свободной цепи ДНК, однако химическое сродство аденина к тимину, а цитозина к гуанину столь велико, что они соединяются друг с другом и в отсутствие ДНК-полимеразы в простой реакционной смеси.

Можно сказать, несколько упрощая, что феномен точного удвоения молекулы ДНК, в основе которого лежит компле-ментарность оснований этой молекулы, составляет молекулярную основу наследственности. Скорость репликации ДНК у человека относительно низкая и для того, чтобы обеспечить репликацию ДНК любой хромосомы человека, требовались бы недели, если бы репликация начиналась из одной точки. На самом деле в молекуле ДНК любой хромосомы, а-каждая хромосома человека содержит только одну молекулу ДНК, имеется множество мест инициации репликации (репликонов). От каждого репликона репликация идет в обоих направлениях до тех пор, пока соседние репликоны не сливаются. Поэтому репликация ДНК в каждой хромосоме протекает относительно быстро.

Реплика?ция (от лат. replicatio — возобновление) — процесс синтеза дочерней молекулы ДНК на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15-20 различных белков, называемый реплисомой (англ. replisome)

Репликация ДНК — ключевое событие в ходе деления клетки. Принципиально, чтобы к моменту деления ДНК была реплицирована полностью и при этом только один раз. Это обеспечивается определёнными механизмами регуляции репликации ДНК.

Репликация проходит в три этапа:

1. Инициация репликации

2. Элонгация

3. Терминация репликации.

Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много. С понятием сайта инициации репликации тесно связано понятие репликон. Репликон — это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий, как правило, представляют собой один репликон, это значит, что репликация всего генома является следствием всего одного акта инициации репликации.

Геномы эукариот (а также их отдельные хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значительно сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы. Молекулярные механизмы, которые контролируют количество актов инициации репликации в каждом сайте за один цикл деления клетки, называются контролем копийности. В бактериальных клетках помимо хромосомной ДНК часто содержатся плазмиды, которые представляют собой отдельные репликоны. У плазмид существуют свои механизмы контроля копийности: они могут обеспечивать синтез как всего одной копии плазмиды за клеточный цикл, так и тысяч копий.

Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка — место непосредственной репликации ДНК. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация одно- или двунаправленной. Более распространена двунаправленная репликация. Через некоторое время после начала репликации в электронный микроскоп можно наблюдать репликационный глазок — участок хромосомы, где ДНК уже реплицирована, окружённый более протяжёнными участками нереплицированной ДНК.

В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс (реплисома), ключевым ферментом которого является ДНК-полимераза. Репликационная вилка движется со скоростью порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту у прокариот и 500-5000 — у эукариот.

Молекулярный механизм репликации:

Ферменты (хеликаза, топоизомераза) и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку. Репликация у эукариот осуществляется несколькими разными ДНК-полимеразами (в отличие от репликации ДНК у прокариот).

ДНК-полимераза I действует на запаздывающей цепи для удаления РНК-праймеров и дорепликации очищенных мест ДНК. ДНК полимераза III — основной фермент репликации ДНК, осуществляющий синтез ведущей цепи ДНК и фрагментов Оказаки при синтезе запаздывающей цепи (фрагменты Оказаки - относительно короткие фрагменты ДНК, которые образуются на отстающей цепи в процессе репликации ДНК). Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципу суперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК. Синтез энергозатратный.

Цепи молекулы ДНК расходятся, образуют репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле.

1. Инициация.

Репликация начинается в строго определенных участках ДНК – точках начала репликации – ori (от англ. origin - начало). Здесь находятся специфические последовательности нуклеотидов – ДНК-боксы, распознаваемые инициаторным белком, с которым связываются впоследствии другие ферменты репликации. Поскольку синтез ДНК происходит только на одноцепочечной матрице, ему должно предшествовать обязательное разделение двух цепей ДНК, т.е. подготовка матрицы, которая включает в себя следующие процессы:

· ДНК-геликазы расплетают двойную спираль ДНК с использованием энергии АТФ. Участок начала расхождения цепей называется репликативной вилкой из-за характерной Y-образной формы.

· ДНК-топоизомеразы снимают топологическое напряжение (суперспирализацию) при раскручивании ДНК. Для этого фермент сначала разрывает цепь ДНК, затем ковалентно присоединяется к разорванному концу. Эта связь обладает значительной энергией, поэтому реакция обратима и не требует дополнительных энергетических затрат. Обнаружено 2 типа топоизомераз: топоизомераза I (вносит однонитевые разрывы) и топоизомераза II (вносит двунитевые разрывы в ДНК).

· SSB-белки (от англ. single-strand DNA-binding proteins) связываются с одноцепочечными участками и стабилизируют расплетенный дуплекс, препятствуя образованию шпилек.

ДНК-матрица готова. Теперь необходимо к каждой из цепей материнской молекулы ДНК достроить из имеющихся в клетке дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) комплементарную цепь. Ферменты, катализирующие детерминируемую ДНК-матрицей реакцию присоединения дезоксирибонуклеотидов, называются ДНК-полимеразами (ДНКП).

Первая ДНК-полимераза была обнаружена в 1957 г. А. Корнбергом, а в 1959 г. за открытие механизма биосинтеза ДНК ему была присуждена Нобелевская премия.

Наиболее хорошо изучены ДНКП у прокариот:

· ДНКП I. Функции:

5’-3’ – экзонуклеаза (может удалять 5’-концевой нуклеотид)

· ДНКП II. Роль до конца неясна. В репликации не участвует.

· ДНКП III. Основной фермент репликации. Функции:

Полимераза (соединяет нуклеотиды фосфодиэфирными связями),

3’-5’ – экзонуклеаза (может удалять 3’-концевой нуклеотид)

ДНКП обладают двумя особенностями:

Во-первых, ДНК-полимеразы не могут начинать синтез ДНК, а способны только добавлять новые дезоксирибонуклеотидные звенья к 3’-концу уже имеющейся полинуклеотидной цепи. Следовательно, ДНКП нуждается в затравке. Затравка (праймер), необходимая для работы ДНКП, состоит из РНК (примерно 15-17 нуклеотидов) и синтезируется ферментом праймазой. Праймаза связывается с геликазой и ДНК, формируя структуру, называемую праймосомой. Затем ДНКП III присоединяется к праймеру и удлиняет цепь.

Во-вторых, синтез новой цепи полимеразы осуществляют только в направлении 5’-3’ вдоль матричной цепи, ориентированной антипараллельно, т.е. 3’-5’. Синтез цепей в обратном направлении не происходит никогда, поэтому синтезируемые цепи в репликативной вилке должны расти в противоположных направлениях. Синтез одной цепи (ведущей, лидирующей) происходит непрерывно, а другой (отстающей) – фрагментами. Ведущая цепь растет от 5’- к 3’ – концу в направлении движения репликативной вилки и нуждается только в одном акте инициации. Рост отстающей цепи также идет от 5’ - к 3’ –концу, но в направлении, противоположном движению репликативной вилки. Для синтеза отстающей цепи должно происходить несколько актов инициации, в результате чего образуется множество коротких цепей (фрагменты Оказаки), длина которых у прокариот составляет 1000-2000 нуклеотидов.

В начале каждого фрагмента Оказаки находится РНК-праймер, который необходимо удалить, т.к. рибонуклеотиды не должны присутствовать в составе ДНК. ДНКП I за счет своей 5’-3’-экзонуклеазной активности удаляет праймер и замещает его дезоксирибонуклеотидами. Брешь между двумя соседними фрагментами Оказаки зашивается ферментом ДНК-лигазой с использованием энергии АТФ.

2. Элонгация (удлинение цепи).

Комплекс ферментов репликации, называемый реплисомой, движется вдоль молекулы ДНК-матрицы, расплетая ее и наращивая комплементарные цепи ДНК.

3. Терминация (окончание репликации).

В ДНК имеются сайты терминации репликации, содержащие специфические последовательности, с которыми связываются терминаторные белки, препятствующие дальнейшему продвижению репликативной вилки. Синтез ДНК заканчивается.

Мы с вами ранее отметили, что кроме полимеразной активности, ДНКП обладают еще и 3’-5’ – экзонуклеазной. Она необходима для коррекции, т.е. удаления неправильно встроенного нуклеотида. ДНКП дважды проверяет соответствие каждого нуклеотида матрице: один раз перед включением его в состав растущей цепи, второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид.

Скорость репликации у прокариот составляет 500 нуклеотидов /сек.

Способы репликации

· θ-тип. Репликативный глазок расширяется в противоположных направлениях вдоль кольцевой молекулы ДНК. При этом образуется промежуточная структура, напоминающая греческую букву θ. Характерен для прокариот и некоторых вирусов.

· σ-тип (механизм «катящегося кольца»). Репликация начинается с разрыва фосфодиэфирной связи в одной из цепей родительской кольцевой молекулы. ДНКП присоединяется к свободному 3’ –концу и наращивает новую цепь. Промежуточная структура имеет форму буквы σ. Этот тип репликации обнаружен у некоторых вирусов, в частности, у бактериофага лямбда.

· Репликация линейных молекул с образованием нескольких репликативных вилок, движущихся друг к другу. Характерна для всех эукариот и вирусов с линейными молекулами ДНК.

Особенности репликации у эукариот

1. Репликация идет в S-период митотического цикла клетки.

2. В одной молекуле ДНК много репликонов, т.е. имеется несколько точек начала репликации.

3. ДНП-полимеразы:

· α – ДНК-полимераза. Основной фермент репликации. Обладает также и активностью праймазы. Синтезирует фрагменты Оказаки.

· β – ДНК-полимераза – фермент репарации (устраняет повреждения ДНК).

· γ – ДНК-полимераза обеспечивает синтез митохондриальной ДНК

· δ – ДНК-полимераза участвует в синтезе ведущей цепи.

4. Длина фрагментов Оказаки составляет 100-200 нуклеотидов.

5. Скорость репликации 50 нуклеотидов / сек.

6. Есть фермент теломераза, удлиняющий перед репликацией 3’-конец ДНК, т.к. каждый раз после репликации длина 3’-конца линейной молекулы ДНК уменьшается на размер праймера. Нарушения удлинения теломер связаны с канцерогенезом и старением.

Таким образом, из рассмотренного выше материала мы можем сделать вывод, что биологический смысл репликации заключается в точном воспроизведении генетической информации, что необходимо для того, чтобы наследственный материал дочерних клеток был идентичен наследственному материалу материнской клетки. Это очень важно как для развития и нормального функционирования многоклеточных организмов, так и для осуществления вегетативного размножения.

Лекция № 2. Репликация ДНК

Согласно гипотезе Дж. Уотсона и Ф. Крика, каждая из цепей двойной спирали ДНК служит матрицей для репликации комплементарных дочерних цепей. При этом образуются две дочерние двухцепочечные молекулы ДНК, идентичные родительской, причем каждая из этих молекул содержит одну неизменную цепь родительской ДНК. Этот механизм репликации ДНК, названный полуконсервативным, был подтвержден в опытах на клетках Е. соli в 1957 г. М. Мезелсоном и Ф. Сталем. Исключены консервативный способ репликации, при котором одна дочерняя ДНК должна содержать обе исходные цепи, а вторая состоять из двух новосинтезированных цепей, и дисперсивный механизм репликации, при котором каждая дочерняя цепь ДНК состоит из участков родительской и новообразованной ДНК (рис.1, слайд 1).

DIV_ADBLOCK226">

3. процесс является симметричным: матрицами служат обе цепи родительской ДНК; также его можно назвать полуконсервативным;

4. удлинение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3’ –концу растущей цепи. Кроме того, поскольку в любой молекуле ДНК комплементарные цепи антипараллелльны, то и растущая цепь антипараллельна матричной цепи. Следовательно, последняя считывается в направлении 3’→5’ (слайд 2 и 3).

5. неспаренная цепь ДНК, которая служит матрицей, и цепь-затравка, к которой присоединяются новые нуклеотиды;

Процесс репликации осуществляется сложным ферментным комплексом. При репликации ДНК у эукариот на каждой хромосоме работает не один, а сразу большое количество таких комплексов. Т. о. на хромосоме имеется много точек начала репликации ДНК. И удвоение ДНК совершается не последовательно от одного конца до другого, а одновременно во многих местах сразу, что значительно сокращает продолжительность процесса (слайд 5). Репликация распространяется в обе стороны от каждой точки начала репликации, при этом образуются репликативные вилки. Между вилками появляется постепенно расширяющееся «вздутие» или «глазок» - это уже реплицированные отделы ДНК. Соседние «вздутия» в конечном счете сливаются и ДНК оказывается удвоенной.

Ферментный комплекс работает так, что одна из двух синтезируемых им цепей растет с некоторым опережением по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется лидирующей, а вторая – запаздывающей. Лидирующая цепь образуется ферментным комлексом в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Его длина (например для сперматогоний) 1 600 000 нуклеотидовю запаздывающая же цепь образуется в виде серии коротких фрагментов – примерно по 1 500 нуклеотидов. Это т. н. фрагменты Оказаки.

Образованию каждого фрагмента ДНК предшествует синтез короткой последовательности (из 10-15 нуклеотидов) РНК-затравки. Дело в том, что ДНК-полимераза (основной фермент синтеза ДНК) не может начинать процесс «с нуля», т. е. в отсутствие олигонуклеотидной прследовательности. А вот фермент синтеза РНК (РНК-полимераза) такой способность обладает; и этот фермент и начинает образование каждого нового фрагмента ДНК.

Ферменты и белки, участвующие в синтезе ДНК: ДНК-полимеразы, топоизомеразы (гиразы), хеликазы и лигазы, праймаза, ssb-белки. Весь комплекс, состоящий более чем из 20 репликативных ферментов и факторов, называется ДНК-репликазной системой, или реплисомой.

ДНК-зависимые ДНК-полимеразы – ключевые ферменты репликативного процесса, использующие принцип комплементарности для наращивания полинуклеотидных цепей. У прокариот есть три ДНК-полимеразы: Pol I, Pol II и Pol III. В репликации ДНК участвуют Pol I и Pol III. ДНК-полимераза I обладает полимеразной и (3’→5’, 5’→3’)-экзонуклеазной активностью, участвует в удалении праймера, застройке бреши, образовавшейся на месте праймера, коррекции ошибок при репликации, а также в репарации ДНК. В клетках E. coli насчитывается около 400 молекул этого фермента. Pol III осуществляет репаративный синтез ДНК.

Основным ферментом, катализирующим биосинтез новообразованной ДНК у прокариот, является ДНК-полимераза III (Pol III). Она обладает полимеразной и 3’→5’- экзонуклеазной активностью; синтезирует лидирующую и отстающую цепь ДНК, обладает корректорской функцией. В клетке содержится 10-20 молекул Pol III, она обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает высокую эффективность копирования.

Активация" href="/text/category/aktivatciya/" rel="bookmark">активации ДНК-полимеразы.

Возникает вопрос, зачем ДНК-полимеразе III 2 типа активности: полимеразная и 3¢→5¢ экзонуклеазная? Дело в том что, точность копирования при репликации ДНК очень высока - на миллиард пар оснований приходится приблизительно одна ошибка. Однако в нормальной ДНК возникают на короткое время редкие таутомерные формы всех четырех оснований. Эти формы образуют неправильные пары. Например, таутомерная форма цитозина спаривается с аденином вместо гуанина, в результате чего возникает мутация (слайд). Значит, высокая точность репликации определяется механизмом, который осуществляет коррекцию, т. е. устранение подобных ошибок. Вот здесь-то и используется 3¢→5¢-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы III. Вступив в контакт с молекулой ДНК, имеющей неспаренный с аденином цитозин, ДНК-полимераза III отщепляет (путем гидролиза) любые неспаренные нуклеотиды.

Имеются доказательства того, что ДНК-полимераза III катализирует сопряженный синтез ведущей (лидирующей) и отстающей цепей ДНК при репликации. ДНК-полимеразы нуждаются в затравке (праймере), поскольку они могут присоединять дезоксирибонуклеотиды только к 3’-ОН-группе. На лидирующей цепи существует 1 праймер, а на отстающей их больше одного. ДНК-полимераза на отстающей цепи синтезирует короткий фрагмент за 4 с, а затем переключается на синтез другого (следующего) фрагмента на участке матричной цепи, расположенном на некотором расстоянии от первого (слайд).

Для каждого короткого фрагмента ДНК-полимеразе требуется затравка (праймер) со спаренным 3¢-концом. Праймеры синтезируются ферментом ДНК-праймазой, которая формирует из рибонуклеозидтрифосфатов короткие РНК-затравки (праймеры), состоящие у эукариот примерно из 10 нуклеотидов (слайд). Затравки синтезируются с определенными интервалами на матрице отстающей цепи, далее их наращивает ДНК-полимераза, начиная всякий раз новый фрагмент Оказаки. Молекула ДНК-полимеразы продолжает наращивание до тех пор, пока она не достигнет затравки (праймера). Для того чтобы обеспечить непрерывность цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает система репарации ДНК, которая удаляет РНК-затравку и заменяет ее на ДНК. Завершает процесс лигаза, соединяющая3¢-конец нового фрагмента с 5¢-концом предыдущего фрагмента.

Двойная цепь ДНК должна расплетаться по ходу продвижения репликационной вилки, для того чтобы поступающие дезоксирибонуклеозидтрифосфаты могли спариваться с родительской матричной цепью. Однако в обычных условиях двойная спираль ДНК стабильна; спаренные основания соединены настолько прочно, что для разделения двух цепей ДНК в пробирке требуются температуры, приближающиеся к точке кипения воды (90°С). Для того, чтобы двойная спираль раскрылась, необходимы два типа белков: геликазы и SSB-белки.

Белки, подготавливающие родительскую ДНК к репликации

а) Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А-Т.

Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связывается несколько молекул специальных узнающих белков. В случае бактерий такие белки называются DnаА (как первые белки, инициирующие репликацию). (Поэтому на рис. узнающий белок обозначен буквой А.)

Можно представить различные причины, по которым становится возможным взаимодействие узнающих белков с точками начала репликации. Среди этих причин:

- само появление в ядре узнающих белков или их определенная модификация;

- освобождение точек начала репликации от неких блокирующих элементов;

- появление в ядре каких-то третьих факторов, необходимых для рассматриваемого взаимодействия; и т. д.

Имеющиеся данные свидетельствуют в пользу первого варианта. Но в любом случае ясно, что здесь - одно из ключевых звеньев, контролирующих начало репликации.

Узнающие белки, обеспечив связывание ДНК-реплицирующего комплекса, видимо, далее не перемещаются вместе с ним по ДНК.

б) Одним же из «первопроходцев» выступает фермент геликаза (на рис. обозначен буквой Г). Он обеспечивает расплетение в районе репликативной вилки двойной спирали родительской ДНК: последняя разъединяется на одноцепочечные участки.

На это затрачивается энергия гидролиза АТФ - по 2 молекулы АТФ на разделение 1 пары нуклеотидов.

Видимо, одновременно происходит также вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками.

в) Однако расплетение спирали на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком.

Дело в том, что каждая молекула ДНК в целом ряде мест зафиксирована на ядерном матриксе. Поэтому она не может свободно вращаться при расплетении какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, а с ней - образование структурного напряжения, блокирующего дальнейшее расплетение двойной спирали.

Проблема решается с помощью ферментов топоизомераз (И на рис.). Очевидно, они функционируют на еще нерасплетенном участке ДНК, т. е. там, где возникает суперспирализация. Топоизомеразы участвуют в процессе раскручивания двойной спирали в репликативной вилке. Эти ферменты изменяют степень сверхспирализации и приводят к образованию «шарнира», который создает условия для непрерывного движения репликативной вилки. Идентифицированы два типа топоизомераз: топоизомеразы I типа надрезают одну из двух цепей ДНК, в результате чего концевой участок двойной спирали может повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплементарные цепи, изменяют степень сверхспирализации, а затем соединяют разорванные концы. Топоизомеразы помогают геликазе раскручивать ДНК для ее репликации. Имеется также топоизомераза II (бактериальная топоизомераза II называется гиразой). Этот фермент разрывает сразу обо цепи ДНК, опять-таки перенося соответствующие концы на себя. Это еще более эффективно позволяет решать проблему супервитков при расплетении ДНК.

Топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, перенося ее проксимальный конец на себя (рис.). Это позволяет дистальному участку ДНК (от места расплетения до места разрыва) вращаться вокруг соответствующей связи целой цепи, что и предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются: один из них переносится с фермента на второй конец. Так что процесс разрыва цепи топоизомеразой легко обратим.

Хеликазы (от лат. helix - спираль, белок dnaB ), осуществляют образование и продвижение вдоль спирали ДНК репликативной вилки – участка молекулы с расплетенными цепями. Эти ферменты для расплетения цепей используют энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР. Хеликазы действуют в комплексе с ssb -белками, которые связываются с одноцепочечными участками молекулы и тем самым стабилизируют расплетенный дуплекс.

г) Итак, «поддерживаемый» топоизомеразами, фермент геликаза осуществляет локальное расплетение двойной спирали ДНК на две отдельные нити.

С каждой из этих нитей сразу связываются специальные SSB-белки. Последние обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии.

Заметим: тем самым данные белки отличаются от гистонов, которые связываются в первую очередь с двухцепочечными участками ДНК.

Ферменты полимеризации

а) Специальный белок выполняет функции активатора праймазы (АП на рис.). После чего праймаза (П), используя в качестве матрицы соответствующий участок одноцепочечной ДНК, синтезирует короткую РНК-затравку, или праймер.

б) Далее в дело вступают ДНК-полимеразы. У эукариот известно 5 разных ДНК-полимераз. Из них β- и ε-полимеразы участвуют в репарации ДНК, γ-полимераза - в репликации митохондриальной ДНК, а α- и δ-полимеразы - в репликации ядерной ДНК.

При этом, по некоторым предположениям, α-полимераза связана и с праймазой, и с δ-полимеразой, а последняя, в свою очередь, - с белком РСNА (Р на рис.).

Данный белок выполняет роль «прищепки», которая крепит комплекс полимераз к реплицируемой цепи ДНК. Считается, что в «застегнутом» состоянии он, как кольцо, обхватывает цепь ДНК (рис.). Тем самым предупреждается преждевременная диссоциация полимераз от данной цепи.

Понятно, что ДНК-полимеразы осуществляют последовательное включение дезоксирибонуклеотидов в строящуюся цепь ДНК - комплементарно нуклотидам родительской цепи.

Но, кроме того, эти ферменты, видимо, имеют и ряд других важных активностей. Правда, для эукарио-тических ДНК-полимераз распределение данных активностей еще не вполне ясно. Поэтому приведем сведения относительно аналогичных бактериальных ферментов.

У бактерий основную «работу» по репликации ДНК выполняет ДНК-полимераза III, имеющая структуру димера. Именно с ней связан «зажим» типа белка РСNА.

Так вот, помимо ДНК-полимеразной активности, ДНК-полимераза III обладает еще одной - 3"→5"-экзонуклеазной. Последняя срабатывает в тех случаях, когда допущена ошибка и в строящуюся цепь включен «неправильный» нуклеотид. Тогда, распознав дефект спаривания оснований, фермент отщепляет с растущего (3"-) конца последний нуклеотид, после чего опять начинает работать как ДНК-полимераза.

Таким образом, происходит постоянный контроль системы за результатом своей деятельности.

в) Как мы знаем, новые цепи ДНК образуются вначале в виде фрагментов - относительно коротких (фрагментов Оказаки) и весьма длинных. И каждый из них начинается с праймерной РНК.

Когда ферментный комплекс, движущийся по родительской цепи, доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента, «зажим», связывающий ДНК-полимеразу III с родительской цепью ДНК, раскрывается, и данный фермент прекращает работу. В действие вступает ДНК-полимераза I (речь по-прежнему идет о бактериальных ферментах). Она присоединяется к З"-концу растущего фрагмента (рис. 1.14). При этом фермент уже не имеет устойчивой связи с данным фрагментом и с родительской цепью, но зато обладает даже не двумя, а тремя активностями.

Первая из них - «передняя», или 5"→3"-экзонуклеазная активность: последовательное отщепление нуклеотидов с 5"-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента.

Концу «своего» фрагмента (ДНК-полимеразная активность).

И, наконец, подобно ДНК-полимеразе III, он «не забывает» проверять и при необходимости корректировать свою деятельность - с помощью «задней», или 3"→5"-экзонуклеазной, активности, направленной на удлиняемый фрагмент.

Функция ДНК-полимеразы I исчерпывается, когда растущий фрагмент вплотную доходит до дезоксирибонуклеотидов предыдущего фрагмента.

Что касается эукариот, то здесь функциональным аналогом бактериальной ДНК-полимеразы III является, видимо, комплекс α- и δ-ДНК-полимераз; при этом корректирующая 3"→5"-экзонуклеазная активность присуща δ-ДНК-полимеразе.

Функции ДНК-полимеразы I тоже распределены между двумя ферментами: 5"→3"-экзонуклеазная активность (удаление РНК-затравки) осуществляется, вероятно, специальной нуклеазой (Н на рис. 1.11), а ДНК-полимеразная активность (застраивание «брешей») - ДНК-полимеразой β (той, что участвует и в репарации).

г) Говоря о ферментах полимеризации, нельзя не сказать о самой трудной из связанных с ними проблем. Речь идет о синтезе запаздывающей цепи ДНК: как мы знаем, направление этого синтеза противоположно общему направлению распространения репликативной вилки.

Имеются, по крайней мере, две гипотезы, объясняющее это противоречие.

По одной из них (рис. 1.15, А), ферментный комплекс периодически прекращает образование лидирующей цепи, переходит на вторую родительскую цепь и синтезирует очередной фрагмент Оказаки запаздывающей цепи. Затем вновь возвращается на первую родительскую цепь и продолжает удлинять лидирующую цепь строящейся ДНК.

По другой версии (рис. 1.15, Б), на второй цепи родительской ДНК (матрице запаздывающей цепи) в процессе репликации формируется петля. Поэтому направление образования фрагмента Оказаки на внутреннем участке петли начинает совпадать с направлением движения полимеразного комплекса. Тогда последний может практически одновременно образовывать сразу обе цепи ДНК - и лидирующую, и запаздывающую.

Возможно, с этим связан тот факт, что бактериальная ДНК-полимераза III является димером, а у эукариот α- и δ-ДНК-полимеразы образуют единый комплекс. Но и при таком механизме запаздывающая цепь, как нетрудно убедиться, не может образовываться непрерывно, а только в виде фрагментов.

Ферменты, завершающие репликацию ДНК

В результате действия всех предыдущих ферментов каждая иовосинтезированная цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу.

«Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (Л на рис. 1.11). Как и ДНК-полимеразы, этот фермент образует межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь.

Но если в полимеразной реакции одним из участников является свободный дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат), то в ДНК-лигазной реакции оба участника - концевые дНМФ (дезоксирибонуклеозидмонофосфаты) в составе «сшиваемых» фрагментов.

По этой причине энергетика реакции иная, и требуется сопряженный гидролиз молекулы АТФ.

Заметим также, что ДНК-лигаза «сшивает» только такие одноцепочечные фрагменты, которые находятся в составе двухцепочечной ДНК.

Но и это еще не все. Молекула ДНК окажется реплицированной не полностью, если не произойдет специальный процесс репликации ее концов, или теломерных участков.

В этом процессе ключевую роль играет фермент теломераза.

Праймазы. Репликация ДНК требует РНК-праймеров. РНК-праймеры синтезируются праймазой (рис. 29.3), кодируемой dnaG геном.

Из рис 29.3 видно, что праймаза состоит из трех доменов:

■ – N-терминальный домен (110 аминокислот), содержит ДНК-связывающий мотив - цинковый палец;

■ – коровый (центральный) домен (322 аминокислоты) содержит каталитический центр;

■ – С-терминальный домен (151 аминокислота), взаимодействующий с dnaB.

Праймеры, синтезируемые праймазой E. coli, начинаются с последовательности pppAG на 5´-конце и состоят примерно из 10-12 нуклеотидов. Праймазы различаются как по структуре, так и по специфичности действия.

ДНК-лигазы катализируют процессы воссоединения фрагментов цепей ДНК, участвуя в образовании ковалентных связей между 5_-Р - и 3_-ОН-группами соседних дезоксирибонуклеотидов. Эти ферменты также используют энергию макроэргических связей, образующуюся при гидролизе АТР.

Репликация ДНК идет в три стадии: инициация, элонгация и терминация .

У бактерий инициация репликации ДНК начинается в уникальном сайте хромосомы, точке репликации – oriC, из которой репликация осуществляется двунаправлено до точки окончания (terminus). В результате образуются две репликативные вилки, которые продвигаются в противоположных направлениях, т. е. обе цепи реплицируются одновременно.

Инициаторный белок dnaA связывается с повторяющимися сайтами связывания на oriC , образуя специализированную нуклеопротеиновую структуру. Это приводит к локальному расхождению АТ-богатой последовательности oriC , которая служит зоной связывания для репликативной хеликазы (dnaB) , и белка dna C /

Далее dnaB активируется удалением dnaC , движется на определенное расстояние в направлении 5_→3_ и взаимодействует с праймазой dnaG . Праймаза синтезирует короткие РНК-праймеры для холофермента ДНК-полимеразы Ш. В месте инициации образуется промежуточный комплекс, состоящий по меньшей мере из пяти белков. Один из них – белок dnaB – может передвигаться вдоль ДНК, используя энергию гидролиза АТР, а также служит сигналом для активации праймазы (рис. 29.5).

Праймаза является компонентом праймосомы, состоящей из нескольких различных субъединиц. В состав праймосомы входит также комплекс белков DnaВ и DnaС , который вблизи репликационной вилки периодически участвует в формировании специфической вторичной структуры ДНК, подходящей для узнавания праймазой.

Инициация репликации ДНК заканчивается образованием репликативной вилки и синтезом РНК-затравки на лидирующей цепи ДНК (рис.29.5) благодаря формированию репликационного комплекса (рис.29.6).

В процессе элонгации происходит наращивание дочерних полинуклеотидных цепей ДНК. Каждая репликативная вилка включает, по крайней мере, две молекулы ДНК-полимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи.

Ведущая цепь ДНК реплицируется непрерывно в направлении, совпадающем с движением репликативной вилки. Отстающая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. Преодоление антипараллельности цепей ДНК при репликации, возможно, достигается путем образования петельной структуры (рис. 29.7).

Вначале на отстающей цепи синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки, названные так по имени их первооткрывателя. Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки (праймера), необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев.